Uji Kualitatif & Kuantitatif Protein
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Tujuan Intruksional KhususSetelah menyelesaikan praktikum, mahasiswa diharapkan mampu :
- Untuk menguji atau mengidentifikasi adanya senyawa protein pada suatu larutan
- Untuk menguji adanya senyawa protein yang memiliki gugus fenol
- Melakukan uji pengendapan protein menggunakan alkohol
- Untuk menguji kadar protein dengan metode pewarnaan protein
- Untuk mengetahui berat protein dalam suatu sampel
1.2. Tinjauan Pustaka
Protein adalah salah satu bio-makromolekul yang penting peranannya dalam makhluk hidup. Fungsi dari protein itu sendiri secara garis besar dapat dibagi ke dalam dua kelompok besar, yaitu sebagai bahan struktural dan sebagai mesin yang bekerja pada tingkat molekular. Apabila tulang dan kitin adalah beton, maka protein struktural adalah dinding batu-batanya. Beberapa protein struktural fibrous protein, berfungsi sebagai pelindung, sebagai contoh α dan β keratin yang terdapat pada kulit, rambut, dan kuku. Sedangkan protein struktural lain ada juga yang berfungsi sebagai perekat, seperti kolagen. Protein dapat memerankan fungsi sebagai bahan struktural karena seperti halnya polimer lain, protein memiliki rantai yang panjang dan juga dapat mengalami cross-linking dan lain-lain. Selain itu protein juga dapat berperan sebagai biokatalis untuk reaksi-reaksi kimia dalam sistem makhluk hidup. Makromolekul ini mengendalikan jalur dan waktu metabolisme yang kompleks untuk menjaga kelangsungan hidup suatu organisme. Suatu sistem metabolisme akan terganggu apabila biokatalis yang berperan di dalamnya mengalami kerusakan. (Hertadi, 2008. rhertadi@biotitech.ac.jp).
Protein merupakan makromolekul yang menyusun lebih dari separuh bagian dari sel. Protein menentukan ukuran dan struktur sel, komponen utama dari sistem komunikasi antar sel serta sebagai katalis berbagai reaksi biokimia di dalam sel. Karena itulah sebagian besar aktivitas penelitian biokimia tertuju pada protein khususnya hormon, antibodi dan enzim. Semua jenis protein terdiri dari rangkaian dan kombinasi dari 20 asam amino. Setiap jenis protein mempunyai jumlah dan urutan asam amino yang khas. Di dalam sel, protein terdapat baik pada membran plasma maupun membran internal yang menyusun organel sel seperti mitokondria, retikulum endoplasma, nukleus dan badan golgi dengan fungsi yang berbeda-beda tergantung pada tempatnya. Protein-protein yang terlibat dalam reaksi biokimia sebagian besar berupa enzim banyak terdapat di dalam sitoplasma dan sebagian terdapat pada kompartemen dari organel sel. Protein merupakan kelompok biomakromolekul yang sangat heterogen. Ketika berada di luar makhluk hidup atau sel, protein sangat tidak stabil. Protein merupakan komponen utama bagi semua benda hidup termasuk mikroorganisme, hewan dan tumbuhan. Keistimewaan lain dari protein ini adalah strukturnya yang mengandung N (15,30-18%), C (52,40%), H (6,90-7,30%), O (21- 23,50%), S (0,8-2%), disamping C, H, O (seperti juga karbohidrat dan lemak), dan S kadang-kadang P, Fe dan Cu (sebagai senyawa kompleks dengan protein). Dengan demikian maka salah satu cara terpenting yang cukup spesifik untuk menentukan jumlah protein secara kuantitatif adalah dengan penentuan kandungan N yang ada dalam bahan makanan atau bahan lain (Sudarmaji, S, dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty: Yogyakarta).
Protein diperkenalkan sebagai molekul makro pemberi keterangan, karena urutan asam amino dari protein tertentu mencerminkan keterangan genetik yang terkandung dalam urutan basa dari bagian yang bersangkutan dalam DNA yang mengarahkan
biosintesis protein. Tiap jenis protein ditandai ciri-cirinya oleh:
1. Susunan kimia yang khas
Setiap protein individual merupakan senyawa murni
2. Bobot molekular yang khas
Semua molekul dalam suatu contoh tertentu dari protein murni mempunyai bobot molekular yang sama. Karena molekulnya yang besar maka protein mudah sekali mengalami perubahan fisik ataupun aktivitas biologisnya.
3. Urutan asam amino yang khas
Urutan asam amino dari protein tertentu adalah terinci secara genetik. Akan tetapi, perubahan-perubahan kecil dalam urutan asam amino dari protein tertentu (Page, D.S. 1997).
Protein pada bagian tubuh tanaman terdapat hampir dalam seluruh bagian tubuh tumbuhan. Protein ditemukan pada daun muda dan pada bagian tubuh lainnya seperti polong, dan buah . Protein adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Tumbuhan menyerap unsur-unsur hara dalam tanah melalui akar dan disalurkan keseluruh bagian tanaman sampai ke daun sehingga tumbuhan membentuk protein dan melakukan perombakan (proses katabolisme). Nitrogen berperan dalam pembentukan sel , jaringan , dan organ tanaman. Ia berfungsi sebagai sebagai bahan sintetis klorofil , protein , dan asam amino. Karena itu kehadirannya dibutuhkan dalam jumlah besar , terutama saat pertumbuhan vegetatif. Dalam unsur-unsur tersebut mengandung unsure Nitrogen yang merupakan unsure pembentuk pada protein. Unsur Nitrogen yang terdapat pada protein adalah 16% dari protein tersebut. Yang banyak tersimpan pada pucuk dan daun muda. Dan masih banyak lagi unsur-unsur yang merupakan pembentuk dari protein yang tersedia pada
tumbuhan.
Beberapa penelitian menunjukkan keberadaan protein yang memiliki letak berbeda-beda pada tumbuhan. Pada famili serealia seperti gandum, padi, polong – polongan dan jagung protein berada pada bagian bijinya. Pada tanaman tembakau, protein banyak ditemukan di bagian daunnya. Sedangkan pada kantong semar, protein banyak ditemukan pada bagian antara batang dengan bunga, selain itu pada buah petai terdapat kandungan protein yang tinggi . Terbentuknya protein bermula dari proses anabolisme dan kemudian dirombak pada tumbuhan tersebut melalui proses katabolisme. Pada tumbuhan protein dapat dilihat dari kandungan Nitrogen pada tumbuhan. Kandungan Nitrogen merupakan unsur yang dominan mempengaruhi pertumbuhan tanaman tersebut. Sehingga tanaman sangat memerlukan Nitrogen untuk pembentukan protein pada tanaman dan apabila kekurangan Nitrogen dapat diartikan sebagai kekurangan protein.
Protein yang terdapat pada makhluk hidup memiliki jenis yang berbeda dan memiliki
fungsi masing-masing. Protein yang dihasilkan oleh tumbuhan berbeda – beda dapat
dicontohkan pada beberapa tanaman sebagai berikut:
Protein prolamin banyak terdapat pada tanaman biji-bijian/sereal seperti beras, polong – polongan dan jagung, tidak memiliki lysine. Pada tanaman polong/kacang-kacangan yang mayoritas mengandung protein yaitu protein globulin, kekurangan cysteine, dan methionine. Protein ini memiliki asam amino yang esensial. Selain itu Menurut Davidson, tanaman memiliki unsur kimia yang dapat melindungi mereka dari herbivora pemakan daun seperti jenis serangga tertentu dan monyet. hal ini menunjukan bahwa tanaman memiliki kandungan protein sebagai pelindung dirinya dari serangan organisme pengganggu.
Kekurangan protein pada tanaman sama dengan kekurangan Nitrogen karena pada
tanaman terdapat 16% Nitrogen penyusun protein gejala kekurangannya yaitu:
a. Tanaman tumbuh kerdil,
b. Daun menguning karena kekurangan klorofil. Lebih lanjut mengering dan rontok.
c. Tulang-tulang di bawah permukaan daun muda tampak pucat.
d. Pertumbuhan tanaman lambat , kerdil dan lemah.
e. Produksi bunga dan biji rendah.
f. Jaringan tanaman mengering dan mati,
BAB II
METODOLOGI PRAKTIKUM
2.1. Uji MillonAlat untuk uji Millon :
- 3 buah tabung reaksi
- Rak tabung reaksi
- Pipet tetes
- Pipet ukur
- Waterbath
- Albumin;kasein;gelatin
- Reagen millon
1. siapkan 3 buah tabung reaksi
2. tambahkan pada masing – masing tabung reaksi 1 ml sampel (albumin;kasein;gelatin)
3. tambahkan 4 tetes reagen millon. Penambahan reagen millon ini bertujuan untuk mendeteksi keberadaan larut protein
4. amati perubahan yang terjadi
5. panaskan dalam waterbath
6. amati perubahan yang terjadi
2.2. Uji Biuret
Alat untuk uji biuret :
- 3 buah tabung reaksi
- Pipet tetes
- Rak tabung reaksi
Bahan – bahan untuk uji biuret
- Albumin;kasein;gelatin
- NaOH 0,1 N
- CuSO4 0,1 N
1. siapkan 3 buah tabung reaksi
2. tambahkan pada masing – masing tabung reaksi 1 ml sampel (albumin;kasein;gelatin)
3. tambahkan 1 ml NaOH 0,1 M. Penambahan NaOH 0,1 M ini bertujuan untuk memecah ikatan sulfida yang terkandung di dalam asam amino
4. tambahkan 2 tetes CuSO4 0,1 M. Sebagai donor Cu2+ yang kemudian akan bereaksi dan membentuk cincin ungu.
5. amati perubahan yang terjadi
2.3. Uji Pengendapan Alkohol 1 & 2
Alat untuk uji pengendapan oleh alkohol 1& 2 :
- 6 buah tabung reaksi
- Rak tabung reaksi
- Pipet ukur
- Pipet tetes
- Albumin
- Kasein
- Buffer asetat
- Etanol
- NaOH
Uji Pengendapan alkohol 1
1. siapkan 3 buah tabung reaksi
2. tambahkan pada masing – masing tabung reaksi 5 ml sampel albumin
3. pada tabung pertama tambahkan 1 ml HCl 0,1M, pada tabung kedua tambahkan 1 ml NaOH 0,1M dan pada tabung ketiga tambahkan 1ml buffer asetat
4. pada masing – masing tabung reaksi tambahkan 6 ml etanol 95%
5. amati perubahan yang terjadi
b. Uji Pengendapan Alkohol 2
1. siapkan 3 buah tabung reaksi
2. tambahkan pada masing – masing tabung reaksi 5 ml sampel kasein
3.pada tabung pertama tambahkan 1 ml HCl 0,1 M, pada tabung kedua tambahkan 1 ml NaOH 0,1 M, pada tabung ketiga tambahkan 1 ml buffer asetat.
4. pada masing – masing tabung reaksi tambahkan 6 ml etanol 95%
5. amati perubahan yang terjadi
2.4. Uji Bradford
a. Persiapan Sampel
Alat untuk uji Bradford (persiapan sampel) :
- Mortal dan pastle
- Mikropipet
- Blue tips
- Eppendorf tube
- Pipet ukur
- Vortex
- Sentrifuge
- Spektrofotometer
Bahan –bahan uji bradford (persiapan sampel) :
- Sampel kedelai bubuk
- Buffer tris
- Reagen bradford
1. siapkan 1 gram sampel kedelai (yang telah dihaluskan )
2. masukkan dalam falcon tube
3. tambahkan 5 ml buffer tris. Penambahan buffer tris ini berguna untuk mengekstraksi protein atau melarutkan protein.
4. sentrifuse 5000 rpm selama 5 – 10 menit
5. pindahkan supernatan (bagian yang cair) pada eppendorf tube
6. sentrifuse 12000 rpm selama 5 – 10 menit
7. ambil supernatan 2 µL
8. tambahkan 1 ml reagen Bradford
9. ukur absorbansi sampel pada Å 595 nm
b. Pembuatan Kurva Standart Protein
Alat untuk uji kurva standart protein :
- Eppendorf tube
- Mikropipet
- Yellow tips
- Spektrofotometer
- BSA (buffine serum albumin)
- Tris buffer
- Reagen bradford
Prosedur Kerja :
1. siapkan 6 buah eppendorf tube
2. kemudian pada masing – masing eppendorf tambahkan :
| Eppendorf | Kons BSA mg/ml | Tris buffer (µL) | Reagen Bradford |
| 1 | 0 | 100 | 1 ml |
| 2 | 0,1 (10 µl) | 90 | 1 ml |
| 3 | 0,2 (20 µl) | 80 | 1 ml |
| 4 | 0,3 (30 µl) | 70 | 1 ml |
| 5 | 0,5 (50 µl) | 50 | 1 ml |
| 6 | 1 (100 µl) | 0 | 1 ml |
- Vortex
- Ukur absorbansi pada Å 595 nm
BAB III
HASIL DAN PERHITUNGAN
1.1. Hasil Praktikum Uji Kualitatif Protein
No
|
Pengujian
|
Sampel
|
Hasil Pengamatan
|
|
I
|
II
|
|||
1
|
Uji Millon
|
Albumin 2%
|
Ada endapan putih (++)
|
Merah, (++), ada endapan
|
Gelatin 2%
|
Tidak ada endapan (-)
|
Merah, (+), tidak ada endapan
|
||
Kasein 2%
|
ada endapan putih (+++)
|
Putih, (-), ada endapan
|
||
2
|
Uji Biuret
|
Albumin 2%
|
++
|
|
Gelatin 2%
|
+++
|
|||
Kasein 2%
|
+
|
|||
3
|
Uji Pengendapan oleh Alkohol 1
|
Albumin 2% (HCl+etanol)
|
-
|
|
Albumin 2% (NaOH+etanol)
|
-
|
|||
Albumin 2% (Buffer asetat +etanol)
|
++
|
|||
Uji Pengendapan oleh Alkohol 2
|
Casein 2% (HCl+etanol)
|
++
|
||
Casein 2% (NaOH+etanol)
|
+
|
|||
Casein 2% (Buffer asetat+etanol)
|
+++
|
|||
|
1.2. Hasil Praktikum Uji Kuantitatif Protein
Eppendorf
|
Konsentrasi
|
Hasil Absorbansi
|
1
|
0
|
0
|
2
|
0,1
|
0,010
|
3
|
0,2
|
0,028
|
4
|
0,3
|
0,046
|
5
|
0,5
|
0,052
|
6
|
1
|
0,190
|
7
|
x
|
0,431
|
Kurva Standart Protein
 |
1.3. Hasil Perhitungan
a. Mencari konsentrasi sampel (x)
Diketahui : nilai konsentrasi sampel (y) = 0,431
Ditanya : konsentrasi sampel (x) ?
|
b. Menghitung kadar protein sampel
Diketahui : xi = 2,276; Fp = 2500; Bs = 1 gram
Ditanya : kadar protein sampel ?
Jawab : kadar protein sampel = 
=
=5690 mg/g
BAB IV
PEMBAHASAN
4.1. Uji Millon
Uji Millon merupakan suatu uji yang dilakukan untuk mengidentifikasi adanya senyawa protein yang
memiliki gugus fenol (seperti tiroksin ) pada suatu sampel. Adanya
protein dalam sampel dapat diketahui apabila dalam sampel tersebut
terdapat endapan putih dan apabila endapan putih itu dipanaskan akan
menjadi merah. Pada uji millon yang telah dilakukan, ada tiga sampel
yang digunakan diantaranya : albumin, kasein dan gelatin. Dari praktikum
tersebut didapatkan hasil sebagai berikut : 1) pada
albumin ketika ditambahkan reagen millon terjadi endapan putih (endapan
lebih banyak) dan ketika dipanaskan berwarna merah (agak pekat) serta
terdapat endapan. 2) pada gelatin ketika ditambahkan reagen millon tidak
terdapat endapan dan setelah dipanaskan berwarna merah (agak pudar) dan
tidak ada endapan. 3) pada kasein ketika ditambahkan reagen millon
terdapat endapan putih (lebih banyak dan jelas) dan ketika dipanaskan
berwarna putih dan terdapat endapan. Dari hasil tersebut, dapat
diketahui bahwa albumin memiliki senyawa protein yang mengandung gugus
fenol. Gelatin tidak memiliki senyawa protein karena pada saat
ditambahkan reagen millon tidak terdapat endapan putih padahal secara
teori tidak. Hal ini dapat terjadi karena kesalahan praktikan pada saat
praktikum. Misalnya, reagen millon yang ditambahkan terlalu sedikit atau
tidak tepat pada cairan gelatin (hanya menempel pada dinding tabung
reaksi). Padahal, jika dilihat pada saat setelah dipanaskan gelatin
tersebut berwarna merah dan ini merupakan indikasi adanya gugus fenol.
Kasein memiliki senyawa protein tetapi tidak mengandung gugus fenol
karena pada saat dipanaskan kasein tidak berubah warna menjadi merah.
1.2.Uji Biuret
Uji
biuret merupakan suatu uji untuk mengetahui ada atau tidaknya ikatan
peptide dalam suatu senyawa sehingga uji biuret dapat dipakai untuk
menunjukkan adanya senyawa protein. Indikasi adanya protein dapat
diketahui apabila larutan berubah warna menjadi ungu. Pada uji biuret
yang telah dilakukan, ada tiga sampel yang digunakan diantaranya :
albumin, gelatin dan kasein. Hasil yang diperoleh dari praktikum
tersebut diantaranya: 1). Pada albumin, larutan berubah warna menjadi
ungu (++ = terjadi perubahan warna lebih banyak), 2). Pada gelatin,
larutan berubah warna menjadi ungu (+++ = warna lebih pekat), 3). Pada
kasein, larutan berubah warna menjadi ungu (+ = sedikit berubah). Dari
hasil pengamatan tersebut dapat diketahui bahwa pada albumin terdapat
ikatan peptide (senyawa protein). Pada gelatin juga terdapat ikatan
peptide (senyawa organik) dan pada kasein juga terdapat ikatan peptide
(senyawa organik).
1.3.Uji Pengendapan Oleh Alkohol
Protein
dapat diendapkan dengan penambahan alkohol. Pada praktikum ini
praktikum dilaksanakan dua kali yakni uji pengendapan alkohol 1 & 2
dengan menggunakan sampel kasein dan albumin. Didapatkan hasil sebagai
berikut : pada uji pengendapan alkohol 1, pada albumin + (HCl &
Etanol) tidak ditemukan endapan. Pada albumin + (NaOH & Etanol)
tidak ditemukan endapan dan pada albumin + (Buffer Asetat & Etanol)
ditemukan endapan lebih banyak (++). Pada kedua sampel di atas terjadi
kesalahan, seharusnya secara teori albumin dapat diendapkan dengan
penambahan HCl + Etanol serta NaOH + Etanol. Namun, pada kenyataannya
tidak ada endapan. Hal ini dapat terjadi karena penambahan HCl + Etanol
maupun NaOH + Etanol kurang, sehingga masih belum mampu mendenaturasi
protein yang ada pada albumin secara sempurna & bisa juga dari
kualitas albumin yang menurun karena penyimpanan yang terlalu lama.
Pada
uji pengendapan alkohol 2, pada kasein + (HCl & Etanol) ditemukan
adanya endapan lebih banyak (++). Pada kasein + (NaOH & Etanol)
ditemukan adanya endapan yang sedikit (+). Dan pada kasein + (Buffer
Asetat & NaOH) ditemukan endapan yang jelas dan sangat banyak (++).
Jadi dapat diketahui, pada saat dilarutkan dengan buffer asetat protein
pada kasein yang mengendap jauh lebih banyak dari kasein yang dilarutkan
pada HCl dan NaOH. Hal ini dapat terjadi karena protein berada pada
titik isolistriknya.
1.4.Uji Bradford
a. Persiapan sampel
Pada
saat uji bradford, sampel yang digunakan adalah serbuk kedelai. Setelah
dilakukan beberapa langkah kerja, didapatkan hasil absorbansi (Å
595 nm) sebesar 0,431 dan -0,283. Hasil absorbansi ini merupakan hasil
yang berarti kurang baik karena pada absorbansi pertama (0,431) nilainya
terlalu besar dan tidak berada pada hasil absorbansi larutan standart
(lihat tabel 3.2.) dan absorbansi kedua (-0,283) nilainya minus sehingga
tidak dapat digunakan untuk perhitungan kadar protein sampel. Hasil
absorbansi yang terlalu besar dapat berarti larutan tersebut masih
sangat pekat sehingga masih perlu dilakukan pengenceran kembali dan
hasil absorbansi yang terlalu kecil dapat berarti bahwa larutan sampel
tersebut terlalu encer (kedua hal ini merupakan ketidaktelitian
praktikan dalam proses pengenceran.
b. Persiapan Kurva Standart
Selain
mempersiapkan sampel, praktikan juga harus membuat larutan standart
dengan menggunakan BSA (Buffin Serum Albumin) pada konsentrasi tertentu.
Setelah melui beberapa langkah kerja, didapatkan hasil absorbansi
sebagai berikut :
Eppendorf
|
Konsentrasi
|
Hasil Absorbansi
|
1
|
0
|
0
|
2
|
0,1
|
0,010
|
3
|
0,2
|
0,028
|
4
|
0,3
|
0,046
|
5
|
0,5
|
0,052
|
6
|
1
|
0,190
|
Hasil absorbansi ini merupakan hasil yang bagus karena dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi mengalami kenaikan.
BAB V
PENUTUP
1.1.Kesimpulan
1. Protein merupakan suatu makromolekul yang sangat penting pada makhluk hidup dan monomernya adalah asam amino
2. Adanya protein dalam suatu bahan/sampel dapat diketahui dengan menggunakan uji millon dan uji biuret
3. Pengendapan
protein oleh alkohol dapat terjadi karena alkohol merupakan pelarut
organik yang dapat menurunkan kelarutan protein, sedangkan HCl dan NaOH
merupakan asam kuat dan basa kuat yang dapat memutuskan jembatan garam
pada struktur tersier protein (sehingga terjadi denaturasi)
4. Uji
bradford (persiapan sampel & penyiapan kurva standart) merupakan
uji kuantitatif untuk mengetahui kadar protein dalam sampel
1.2.Saran
1. Praktikan seharusnya meningkatkan ketelitiannya serta keterampilannya terutama pada saat pengenceran larutan
2. Praktikan
seharusnya berhati – hati dalam penambahan reagen (agar tidak terlalu
sedikit maupun terlalu banyak) sehingga data yang dihasilkan benar –
benar merupakan data yang valid
DAFTAR PUSTAKA
opansopandi.files.wordpress.com/2009/06/protein-dalam-tumbuhan.pdf diakses 17 November 2013
rgmaisyah.files.wordpress.com/2008/12/analisis-protein.pdf diakses 17 November 2013
http://panggilakukhofiyaa.blogspot.com/2013/03/part-4-b-uji-kualitatif-protein.html diakses 20 November 2013
No comments:
Post a Comment